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Alfa-L-fucosidase

α-L-fucosidases são glicosidases capazes de realizar a clivagem de glicoconjugados contendo ligações α-L fucose. Essa enzima já foi purificada em vários organismos, como bactérias, fungos, protozoários, além de em vários tecidos de mamíferos.[2] O estudo dessas enzimas é uma importante ferramenta para elucidação da estrutura de carboidratos complexos e a função da α-L-fucose nos vários compartimentos celulares.[3] Essas enzimas estão envolvidas em uma variedade de processos biológicos; sua deficiência causa uma desordem que leva ao acúmulo de Fucose, denominada fucosidose, sendo esta uma doença letal.[4]

Marcação de alfa fucosidase em células HeLa.[1]

Informações

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E.C.: 3.2.1.51[4][5]

pH: Atividade máxima entre pH 4,0 e pH 6,5.[5][6]

Sinônimos: FUCA1, AFU, ALF, hFUC.[4][7][8]

 
Mecanismo de catálise proposto para α-fucosidase[9]

Produto: alpha-L-fucose + álcool.[5]

Estabilidade: A adição de 0,015% de Triton X-100 retém cerca de 100% da atividade enzimática por cerca de 3 meses quando mantida sob congelamento e por cerca de 2 semanas se mantida a 4°C.[6]

Família Gênica: Pertence a família 29 de Glicosídeo hidrolases (GH29).[10][11][12]

Estrutura: Proteína multimérica contendo subunidades com cerca de 50-60 kDa. Diferenças estruturais são encontradas em função de sua localização tecidual. Isso pode ser atribuído a variações no conteúdo de ácido siálico presentes nos tecidos, bem como mutações nos alelos gênicos.[4][6]

Isoformas: Cerca de 5 isoformas foram descritas até o momento.

Substratos e Parâmetros Cinéticos: São descritos valores de Km de 0,07 mM para 4-Metilumbeliferil α-L-fucopyranoside e Km de 0,18 mM para 4- Nitrophenyl-alpha-L-fucopiranoside.[5]

Inibidores: Inibição de α-fucosidase humana pode ser efetuada através de N-benzyl aminocyclopentitols, obtendo Ki de 0,3 mM. Enquanto a inibição da enzima em Bos taurus pode ser efetuada empregando Deoxyfuconojirimycin Ki = 0,24 μM, apresentando mecanismo de inibição competitiva, bem como pelo emprego de D-1-Deoxyrhamnojirimycin, apresentando Ki = 11 μM e mecanismo de inibição competitiva.[5][13]

Organismos: Encontrada em diversos organismos como plantas, fungos, bactérias e mamíferos. Diferenças na hidrólise de substratos artificiais são encontradas para espécies distintas. Em mamíferos e alguns organismos marinhos é possível observar hidrólise de substratos variados, como p-nitrophenyl, α-L-fucopyranoside e methyl α-L-fucopyranoside. Entretanto em alguns microorganismos encontramos capacidade de hidrólise apenas para ligação fucosídica de substratos naturais.[5][14]

 
Detecção de alfa fucosidase humana em Western Blot[1]

Função: Participa do metabolismo de fucose e de compostos contendo fucose, como oligossacarídeos, glicolipídeos e glicoproteínas. Possui participação na resposta imune, transdução de sinal, embriogênese, apoptose, adesão de patógenos, extravasamento de leucócitos e em processos patológicos, como câncer e aterosclerose.[4]

Importância Fisiológica: A redução ou mutações nesta enzima em humanos leva ao desenvolvimento de fucosidose, patologia caracterizada pelo acúmulo de fucoglicoconjugados em vísceras e cérebro, resultando em retardo motor e mental, sendo, geralmente, fatal.[4][10]

Utilização: Emprego da enzima como biomarcador para detecção de hepatocarcinoma de fase aguda, e recorrência de câncer colorretal.[15]

Purificação da enzima: Após obtenção do tecido/amostra de interesse, são incubados a 37ºC para desprendimento da proteína. Posteriormente é efetuada precipitação com saturação de sulfato de amônio (35 – 50%), seguida decentrifugação a 35000 rpm e posteriormente submetida novamente a etapa de precipitação. O sobrenadante obtido nas etapas de precipitação é submetido a ultrafiltração de maneira a reduzir o volume de amostra, seguida por novas etapas de precipitação e, por fim, levada a coluna de troca iônica constituída de CM-celulose. A validação do material purificado é obtida através de verificação de atividade específica, bem como pela realização de Western Blotting empregando anticorpo policlonal antiAFU. A estabilidade da enzima é observada em pH 5,0, podendo ser congelada por, pelo menos, dois meses.[6][7][11][16]

Referências

  1. ↑ a b «Human FUCA1 Affinity Purified Polyclonal Ab: R&D Systems». www.rndsystems.com. Consultado em 11 de dezembro de 2015 
  2. ↑ «[97] 1,2-α-l-fucosidase from Clostridium perfringens - University of Michigan - SciVal Experts 4.6». www.experts.umich.edu. Consultado em 6 de dezembro de 2015 
  3. ↑ Glycobiology: A Practical Approach First Edition ed. Oxford: IRL Press. 31 de março de 1994. ISBN 9780199633715 
  4. ↑ a b c d e f Liu, Sheng-Wen; Chao-Sheng (12 de dezembro de 2008). «Identification of Essential Residues of Human α- l -Fucosidase and Tests of Its Mechanism †». Biochemistry (em inglês). 48 (1): 110-120. doi:10.1021/bi801529t 
  5. ↑ a b c d e f «BRENDA - Information on EC 3.2.1.51 - alpha-L-fucosidase». www.brenda-enzymes.info. Consultado em 8 de dezembro de 2015 
  6. ↑ a b c d Khunsook, Sumpars; Jack A. (1 de março de 2002). «Purification and characterization of human seminal plasma α-l-fucosidase». Molecular Human Reproduction (em inglês). 8 (3): 221-227. ISSN 1360-9947. PMID 11870229. doi:10.1093/molehr/8.3.221 
  7. ↑ a b Li, Chao; Jie (21 de junho de 2006). «Purification and characterization of α-L-fucosidase from human primary hepatocarcinoma tissue». World Journal of Gastroenterology : WJG. 12 (23): 3770-3775. ISSN 1007-9327. PMID 16773698. doi:10.3748/wjg.v12.i23.3770 
  8. ↑ Ali, Simi; Yvonne (15 de agosto de 2008). «Leukocyte extravasation: an immunoregulatory role for alpha-L-fucosidase?». Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 181 (4): 2407-2413. ISSN 1550-6606. PMID 18684930 
  9. ↑ Liu, Sheng-Wen; Chao-Sheng (13 de janeiro de 2009). «Identification of Essential Residues of Human α-l-Fucosidase and Tests of Its Mechanism†». Biochemistry. 48 (1): 110-120. ISSN 0006-2960. doi:10.1021/bi801529t 
  10. ↑ a b Cobucci-Ponzano, Beatrice; Antonio (25 de julho de 2003). «Identification of the Catalytic Nucleophile of the Family 29 α- l -Fucosidase from Sulfolobus solfataricus via Chemical Rescue of an Inactive Mutant †». Biochemistry (em inglês). 42 (32): 9525-9531. doi:10.1021/bi035036t 
  11. ↑ a b Benešová, Eva; Petra (27 de maio de 2015). «Alpha-l-Fucosidase Isoenzyme iso2 from Paenibacillus thiaminolyticus». BMC Biotechnology (em inglês). 15 (1). 36 páginas. ISSN 1472-6750. PMID 26013545. doi:10.1186/s12896-015-0160-x 
  12. ↑ Intra, Jari; Maria-Elisa (1 de maio de 2007). «Comparative and phylogenetic analysis of α-l-fucosidase genes». Gene. 392 (1–2): 34-46. doi:10.1016/j.gene.2006.11.002 
  13. ↑ Blaser, Adrian; Jean-Louis (1 de junho de 2000). «Stereoselective Inhibition of α-l-Fucosidases by N-Benzyl Aminocyclopentitols». Organic Letters. 2 (12): 1733-1736. ISSN 1523-7060. doi:10.1021/ol005895z 
  14. ↑ Eneyskaya, E. V.; A. A. (1 de outubro de 2001). «An alpha-L-fucosidase from Thermus sp. with unusually broad specificity». Glycoconjugate Journal. 18 (10): 827-834. ISSN 0282-0080. PMID 12441672 
  15. ↑ Ho, Ching-Wen; Yu-Nong (1 de maio de 2006). «Discovery of Different Types of Inhibition between the Human and Thermotoga maritima α-Fucosidases by Fuconojirimycin-Based Derivatives†». Biochemistry. 45 (18): 5695-5702. ISSN 0006-2960. doi:10.1021/bi052559n 
  16. ↑ «Purification of alpha-L-fucosidase from various sources by affinity chromatography.». ResearchGate. doi:10.1016/S0021-9673(00)89322-X. Consultado em 11 de dezembro de 2015 
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