ELISA

 Nota: Para outros significados do nome Elisa, veja Elisa.

ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou ensaio de imunoabsorção enzimática é um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos (por exemplo, no plasma sanguíneo). Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas, entre outras. Neste teste, é necessário fixar o antígeno a uma superfície sólida, e então ligar ao antígeno um anticorpo ligado a um marcador enzimático. A detecção se completa ao analisar a presença do marcador depois de lavar os poços, que - no caso da detecção enzimática - vai mudar a coloração do substrato cromogênico adicionado a placa de teste.

Uma microplaca de 96 poços usada para ELISA

História

Antes do surgimento do ELISA, os testes de imunodetecção utilizavam marcadores radioativos.  Esses marcadores indicavam a presença do antígeno ou do anticorpo procurado na amostra. A técnica da radioimunodetecção foi desenvolvida pelos médicos Rosalyn Sussman Yalow e Solomon Berson, rendendo a Rosalyn um Prêmio Nobel.

Todavia, por utilizar marcadores radioativos, a técnica apresentava sérios riscos para a saúde dos pacientes. Dessa forma, iniciou-se pesquisas a fim de desenvolver técnicas que utilizavam marcadores não radioativos, início do desenvolvimento do ELISA. A técnica desenvolvida baseava-se no princípio de que, quando uma enzima reage com o substrato específico há uma mudança na coloração. Essa mudança de coloração passou a ser usada, então, como um método alternativo de marcador. O processo de ligação entre enzima e substrato foi inicialmente divulgado por dois cientistas de forma independente: Stratis Avrameas e G. B. Pierce.

Além disso, como o processo requer a lavagem para realizar a detecção, um método de fixação foi desenvolvido, em 1966, por Wide e Jerker Porath.

Finalmente, em 1971 Peter Perlmann e Eva Engvall da Universidade de Estocolmo publicaram toda a síntese desses conhecimentos, consolidando a técnica do ELISA

O desenvolvimento dessa técnica é de grande importância clínica por apresentar um bom custo e benefício e ser muito utilizado para a detecção de doenças virais, principalmente aos casos de detecção do vírus HIV.

Princípio

O ELISA se baseia em fixar compostos nos poços e então lavar para remover outros compostos que não tiveram a especificidade para se fixarem no poço.

O método utilizado para realizar o teste baseia-se na interação antígeno-anticorpo. Geralmente, o ELISA é realizado em placas com 96 poços, onde são ligados antígenos, diretamente, ou indiretamente, por meio de um anticorpo já selecionado e ligado ao poço. É essa ligação e imobilização dos reagente que permite que o ELISA fique mais fácil de se realizar. O fato de imobilizar os reagentes na placa torna fácil separar os materiais que foram fixados e os que não foram durante o teste. E essa possibilidade de lavar materiais é o que torna o ELISA uma ferramenta poderosa de medição de um composto específico com uma preparação básica.

Diferentes formas do ELISA

Depois de fixar o antígeno, é necessário ligar um marcador acoplado a anticorpo, para detectar posteriormente a presença do antígeno esperado. Esse marcador pode ser fluorescente ou pode ser uma enzima que catalize uma reação que produza um produto mensurável. E essa ligação se dá por anticorpos específicos ao antígeno, por isso a precisão do teste. O marcador de detecção pode ser ligado diretamente ao anticorpo primário ou introduzido por meio de um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário.

As enzimas de detecção mais utilizadas são peroxidases e fosfatases. Outras enzimas, como β-galactosidases, acetilcolinesterases e catalases podem ser usadas também, mas tem um número reduzido de substratos, por isso seu uso é menos difundido. A escolha de qual marcador utilizar depende da sensibilidade necessária do teste e dos equipamentos de detecção disponíveis (espectrofotômetro, luminímetro, fluorímetro).

Tipos de teste

O ELISA pode ser feito com inúmeras modificações do procedimento básico. O passo crucial, fixar o antígeno, pode ser realizado por adsorção direta ou indireta por meio de um anticorpo de captura. O antígeno pode ser detectado, também, diretamente, pelo anticorpo primário, ou indiretamente, pelo anticorpo secundário.

Entretanto, é necessário compreender o procedimento básico: independente do tipo de ELISA, o antígeno vai ser marcado por um anticorpo conjugado a uma enzima. Após a lavagem para a retirada dos anticorpos que não se ligaram a nenhum antígeno, é adicionado ao meio de análise um substrato com a capacidade de reagir com a enzima que foi acoplada ao anticorpo. Esse substrato, por sua vez, é cromogênico, e após a reação, muda sua cor. Assim, quando há a presença do antígeno em análise, os equipamentos de detecção percebem e quantificam a mudança de cor observada, cuja intensidade se refere a concentração de substrato que reagiu com a enzima, atestando maior ou menor concentração do antígeno.

ELISA Direto

Corresponde ao procedimento básico do ELISA, ou seja, não utiliza anticorpos de captura ou alvos de competição. Basicamente corresponde as etapas de: adição de amostra tamponada a placa de teste; posterior adição de anticorpo primário acoplado a enzima e adição de substrato cromogênico. Instrumentos como espectrômetros avaliam qualitativamente e quantitativamente a variação de cor e a presença do antígeno.

Dessa forma, conclui-se que a denominação de ELISA direto se refere somente a utilização de um anticorpo primário, que marca o antígeno diretamente.

ELISA Indireto

O ELISA indireto faz o uso de dois anticorpos: o anticorpo primário e o anticorpo secundário.  Primeiramente, a amostra é preparada com o anticorpo primário, que possui especificidade com o antígeno a ser detectado. Caso o antígeno a ser procurado esteja presente na amostra, o anticorpo primário irá se ligar ao seu alvo. Em seguida, haverá uma lavagem para retirar os anticorpos que não se ligaram ao antígeno teste. A seguir, coloca-se os anticorpos secundários que possuem especificidade apenas para os anticorpos primários. Caso os anticorpos primários tenham se ligado ao antígeno, haverá ligação entre anticorpo primário e anticorpo secundário e isso que irá permitir a detecção.

Dessa forma, a característica marcante do ELISA indireto é a utilização de anticorpos secundários para um maior nível de especificidade do teste.

ELISA Sanduíche

Um dos formatos mais eficazes é o sanduíche, que é chamado assim pois o antígeno fica entre dois anticorpos, o de captura e o de detecção, e é usado por ser robusto e sensível ao mesmo tempo.

Nesse tipo de ELISA, primeiramente são ligados ao fundo do placa de teste os anticorpos de captura, impedindo que haja outros pontos de ligação fortes para o antígeno. A seguir, é adicionada a amostra de interesse, e caso exista antígeno específico procurado, este se liga aos anticorpos de captura. Em seguida é feita uma lavagem para a retirada de antígenos que não se ligaram aos anticorpos de captura. Posteriormente, são adicionados a amostra os anticorpos conjugados a enzima, que farão o reconhecimento da presença do antígeno. A seguir é feita uma segunda lavagem para a retirada dos anticorpos conjugados que não se ligaram a amostra e, por fim, é adicionado o substrato que reage com a enzima, que promove a mudança de cor ou fluorescência.

Como essa técnica utiliza anticorpos de captura, há um aumento da especificidade da ligação destes com a amostra. Dessa forma, não há necessidade de purificá-la, evitando a competição com outros antígenos e melhorando o processo de análise. Além disso, é comum que os anticorpos conjugados a enzimas reconheçam e possam se ligar a regiões do anticorpo ligado ao antígeno. Em suma, esse processo é bastante específico, podendo ser utilizado para exames contra falsos-positivos.

ELISA por Competição

Além dos formatos de ELISA direto, indireto e sanduíche, há ainda o método por competição, que é mais utilizado quando o antígeno é pequeno e possui poucos epítopos, ou pontos de ligação com o anticorpo.

Alguns kits ELISA competitivos incluem o antígeno ligado à enzima em vez do anticorpo ligado à enzima. O antígeno marcado compete pelos sítios de ligação do anticorpo primário com o antígeno da amostra (também chamado de antígeno teste). Quanto menos antígeno na amostra, mais o antígeno marcado é retido no poço e mais forte é o sinal. Comumente, o antígeno não é primeiro posicionado no poço, já que primeiramente é acoplado o anticorpo de captura.

Nesse formato, junto com a amostra é adicionado antígeno semelhante ao que se procura nela, mas com o marcador (enzima). Assim, na amostra, antígeno com marcador - adicionado artificialmente - e antígeno sem marcador - procurado no teste - irão competir pelos anticorpos de captura. Na fase de detecção, após a lavagem da amostra e retirada dos antígenos que não se ligaram aos anticorpos de captura presentes na placa, se o sinal (mudança de cor) estiver reduzido significa que antígenos procurados no teste se ligaram, comprovando sua presença em grande concentração na amostra. Entretanto, se a mudança de cor for acentuada, é menor a concentração do antígeno teste, que competitivamente não conseguiu se ligar aos anticorpos de captura.

Comparação entre a detecção direta e indireta

ELISA por detecção direta

Vantagens:

1. Rápido pois só é necessário aplicar um anticorpo;
2. Remove a necessidade de ter um anticorpo secundário, que deve ser específico para o anticorpo primário;

Desvantagens:

1. A especificidade do anticorpo primário pode ser afetada pela ligação ao marcador de detecção;
2. Criar anticorpos primário para cada ELISA é demorado e caro;
3. Baixa amplificação do sinal para a detecção;
4. Sem flexibilidade para mudar o marcador do anticorpo primário de um teste para o outro;

ELISA por detecção indireta

Vantagens:

1. Uma grande variedade de anticorpos secundários com diferentes marcadores estão disponíveis para venda;
2. Versátil pois vários anticorpos primários podem ser usados no mesmo teste enquanto se usa apenas um anticorpo secundário;
3. Não há risco de afetar a especificidade do anticorpo primário;
4. Sensibilidade maior, pois cada anticorpo primário tem vários epítopos em que o anticorpo secundário pode se ligar, o que amplifica o sinal;

Desvantagens:

1. Mais uma etapa para adicionar o anticorpo secundário;
2. Pode ocorrer de o anticorpo secundário não ser específico apenas para o anticorpo primário o que resultaria em um resultado falso-positivo;

Outras formas de ELISA

ELISPOT

Similar ao western blot, esse método detecta os compostos assim que a célula secreta. No ELISPOT, o substrato precipita conforme a célula secreta o composto, assim, é possível ver sua velocidade de produção.

O ELISpot aplica a técnica de sanduíche do ELISA. Um anticorpo de captura para a substância que se deseja detectar é aplicado aos poços. Então uma cultura de células é colocado nos poços e a microplaca é mantida em uma incubadora em um período específico para que as células se desenvolvam. Durante a incubação, o anticorpo de captura, nas proximidades da célula, se liga à substância analisada. Depois de remover por meio da lavagem qualquer célula e outras substâncias que não se fixaram, o anticorpo de detecção é adicionado.

A vantagem desse método é que ele detecta a substância assim que ela é secretada pela célula, ou seja algumas proteínas que seriam degradadas ou que se ligariam a ligantes podem ser detectadas nesse método. Além disso, o ELISpot é um dos métodos de análise de secreções de células mais preciso, com precisão de aproximadamente 1 célula a cada 100.000, ou seja, se apenas uma célula a cada 100.000 secrete a substância, o ELISpot ainda dará positivo. E com isso, em um mesmo poço podem ser detectadas várias pontos, sendo que cada ponto é onde tinha uma célula secretando a substância. Nesse sentido o ELISpot é muito usado para detectar a frequência de células que secretam ao nível de células individuais. Por ser um teste muito preciso, o ELISpot é geralmente usado para detectar as células que secretam citocinas e para detectar a frequência em populações de células muito pequenas encontradas em respostas imunes.

ELISA intracelular

Nesse método, uma cultura de células é fixada nos poços e tem suas membranas permeabilizadas. Então, os compostos intracelulares são detectados por anticorpos específicos. A quantificação de proteínas intracelulares e eventos de fosforilação é extremamente importante para a pesquisa biomédica. Embora o Western Blot seja o método mais amplamente utilizado, é trabalhoso e demorado, especialmente quando se analisam múltiplas amostras. O imunoensaio baseado em placas tornou-se um método alternativo popular para detecção rápida de proteínas. Foi desenvolvido um ELISA baseado em células fluorogênicas que não requer preparação de lisado ou os múltiplos passos subsequentes necessários para a análise de Western blot. O formato ELISA Intracelular permite que duas proteínas celulares alvo, ou eventos, sejam analisados ​​simultaneamente. As células são cultivadas em placas de 96 poços e tratadas com as condições apropriadas, tais como inibidores ou estimulação de ligantes. As células são então fixadas e permeabilizadas nos poços. Isto é seguido por incubação com dois anticorpos primários derivados de espécies diferentes: um anticorpo fosfo-específico e um anticorpo de normalização que reconhece a proteína total, independentemente do seu estado de fosforilação. Anticorpos secundários específicos de espécies marcados com Peroxidase de Horseradish  (HRP) e fosfatase alcalina (AP), e substratos fluorogênicos espectralmente distintos para cada enzima, utilizados para detecção. A fluorescência da proteína fosforilada é normalizada para a proteína total em cada poço para corrigir variações nas análises. ELISAs baseados em células têm sido usados ​​para avaliar os efeitos de estimuladores e inibidores em células cultivadas, e isso foi realizado com 10.000 células, ou menos, por preparação. Por exemplo, a fosforilação de JNK (T183 / Y185), Akt (S473), EGFR (Y1068), FRS2 (Y436), níveis de proteína total de IκBα induzida por vários estímulos, e os efeitos de inibidores de quinase, foram avaliados aqui usando o Método ELISA Baseado em Células. Os resultados foram comparados com Western blot e ELISA sanduíche tradicional. Uma vez que as células são plaqueadas em microplacas de 96 poços, o tempo total de hands-on para o ELISA intracelular é de aproximadamente 3 horas, o que é significativamente menor do que outras técnicas. Além disso, ELISAs Baseados em Células são passíveis de aplicações de alto rendimento e podem ser uma adição valiosa às estratégias inibidores de quinases.

Estratégias de detecção para o ELISA

O estágio final em todos os testes de ELISA é a detecção. A não ser que um marcador fluorescente seja utilizado, essa etapa envolve a introdução do substrato da enzima marcadora. A enzima converte o substrato em um produto detectável. Se os passos anteriores do ELISA foram realizados corretamente, a intensidade do sinal produzido quando o substrato foi adicionado será diretamente proporcional à quantidade de antígeno capturado na placa e ligado aos anticorpos de detecção. Anticorpos conjugados a enzimas oferecem a maior flexibilidade em relação a métodos de detecção por causa da variedade de substratos que mudam de cor ou que possuem quimioluminescência.

Diagnóstico

Entre as doenças passíveis de diagnóstico pelo teste, estão várias doenças infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos desencadeia a produção de imunoglobulinas. Também pode ser usado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alergias.

HIV

Este é o teste de primeira linha no diagnóstico da infecção pelo HIV (vírus da SIDA/AIDS). Estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato. No entanto, os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV (a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.

Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.

Radioimunoensaio

O teste ELISA também pode ser utilizado de diversas outras formas. Utilizando-se de um método semelhante ao método de radioimunoensaio, pode-se transformar muitas outras substâncias em antígeno e obter um anticorpo do mesmo. Assim, é possível utilizar o teste para se detectar outras substâncias de interesse como, por exemplo, hormônios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, o teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata.

Ver também

Carga viral

Referências

3. Teste de Elisa [1]

4. depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/ELISA.doc

5. https://www.rndsystems.com/resources/posters/novel-cell-based-elisa-intracellular-proteins-or-phosphorylation-signaling-molecules

6. https://resources.rndsystems.com/images/site/sci_poster_Dev_of_Cell_Based_ELISA_for_IC_proteins_August_2010_final6758.pdf<